StrAtegie agronomiche, tecnologiche e microbiologiche per Controllare e mitigare il Rischio di formazione di Acrilammide nella pasta e nel pane di frumento duro
ProgettoIl progetto pone l’attenzione sui fattori cruciali che aumentano il rischio di esposizione dei consuma-tori di alimenti derivati dai cereali, pasta e pane di grano duro in particolare, all’acrilammide. L'acri-lammide è una tossina a consolidato potenziale cancerogeno, che si sviluppa durante la lavorazio-ne ad alta temperatura. Questo tema non è mai stato studiato sulla pasta, mentre sul pane di grano tenero sono stati condotti molti studi. In Italia, soprattutto nelle regioni del centro-sud, è molto diffusa la produzione e il consumo di pane di frumento duro. Nella produzione della pasta, la diffusione dei cicli di essiccazione ad alta e altissima temperatura se da una parte ha indubbiamente aumentato la produttività dei pastifici, dall’altra ha aumentato il rischio della formazione di sostanze potenzialmen-te dannose per la salute, tra cui l’acrilammide. La presente proposta progettuale si propone di dare delle risposte che siano basate sui risultati scientifici sugli effetti delle tecniche agronomiche, mi-crobiologiche e tecnologiche sulla formazione di questo composto. È’ noto che durante la fase di asciugatura, viene rimosso più del 50% dell'acqua totale contenuta nella pasta ed il contenuto di umidità raggiunge valori del 12-13 %. Queste condizioni di umidità, equivalenti ad una attività dell’acqua di 0,8 ed in presenza di zuccheri riducenti e asparagina libera sono riconosciute come condizioni ottimali per lo sviluppo della Reazione di Maillard e successiva formazione di acrilammi-de. Ugualmente succede nel pane, dove la cottura è certamente la fase più critica per la formazione di acrilammide, in presenza dei precursori già menzionati. Nel grano gli amminoacidi liberi rappre-sentano generalmente meno del 5% dell’azoto totale presente nelle cariossidi e inoltre, la disponibili-tà di azoto correla positivamente con totale di aminoacidi liberi, tra cui l’aspragina. Nei cereali, inol-tre la concimazione minerale gioca un ruolo fondamentale nel determinare la qualità e la quantità delle proteine; in particolare la disponibilità di azoto e l’epoca fenologica in cui viene effettuata la fer-tilizzazione. Infatti, le concimazioni azotate più efficaci ad aumentare il contenuto proteico sono quelle effettuate in post-antesi. Tra i fattori coinvolti nell’aumento di asparagina libera, una carenza di zolfo particolarmente severa può causare un aumento fino a 30 volte rispetto ad una situazione in cui lo S non è carente. In queste condizioni l’asparagina libera può arrivare a costituire fino al 50% del pool totale di aminoacidi liberi.
Pertanto, nella presente proposta progettuale che si articola in sei WP, abbiamo previsto lo svolgi-mento di prove agronomiche di concimazione a base di S e N in due località con due varietà di fru-mento duro tra le più coltivate e utilizzate per la pastificazione e panificazione. Le prove agronomi-che saranno svolte in due ambienti con differenti condizioni pedo-climatiche, presso le due aziende delle UO1 (CREA) e UO2 ( UNITUS) altamente specializzate nella conduzione di prove agronomi-che sui cereali. Nello specifico a Viterbo presso l’azienda Didattico-Sperimentale Nello Lupori dell’Università della Tuscia e a Foggia presso l’azienda sperimentale Manfredini del CREA-CI. La sperimentazione in campo prevede un disegno sperimentale con i seguenti trattamenti: due varietà di frumento duro; due dosi di fertilizzante N (80 kg/ha, 110 kg/ha), due dosi di fertilizzante S (30kg/ha, 50 kg/ha) tre repliche. La tecnica agronomica applicata relativamente ai tempi di interven-to sarà quella normalmente adottata in centro Italia per la produzione del frumento duro. Durante il ciclo vegetativo della coltura saranno rilevati paramenti fisiologici al fine di comprendere l’efficienza d’uso delle risorse da parte della pianta. Prima della semina e dopo la raccolta saranno effettuati campioni di suolo per rilevarne i principali parametri di fertilità. La valutazione degli stress di natura biotica della coltura in funzione delle tesi sperimentali avverrà in campo attraverso l’analisi epide-miologica ed eziologica delle principali malattie del grano duro con particolare riferimento alla fusa-riosi ed al “black points” della spiga. La granella ottenuta dalle prove agronomiche sarà analizzata per il contenuto di asparagina libera presso i laboratori del Centro CREA-AN che vanta una conso-lidata esperienza nel settore delle ricerche sugli alimenti. Verrà effettuata l’analisi dei principali gruppi funzionali -analisi “fingerprint”- sui campioni di granella ottenuti dalle prove agronomiche at-traverso la Spettroscopia Infrarossa a Trasformata di Fourier con Riflettanza Totale Attenuata (FTIR-ATR). La FTIR-ATR è un esempio di tecnica innovativa, rapida, non distruttiva, green, con una minima fase di preparazione del campione ed un uso minimo di solventi che permette di identi-ficare ‘l'impronta digitale’ di un prodotto. Il contenuto di asparagina libera sarà misurato anche con la tecnica LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) e ciò consentirà di ottenere una prima indicazione sulla corretta gestione della concimazione in termini quantitativi e di timing di applica-zione. Contestualmente i campioni che presentano il contenuto di asparagina libera più contrastante saranno avviati alle successive fasi di trasformazioni tecnologiche a cura del CREA-CI e CREA-IT. I campioni di grano duro saranno sottoposti, previo condizionamento, a macinazione con mulino a cilindri, al fine di ottenere semola e ‘scarti’ di macinazione (crusca + cruschello). Tali scarti ver-ranno micronizzati ed utilizzati in miscela con le semole per ottenere sfarinati integrali ricostituiti. I sottocampioni provenienti dalle diverse tecniche di macinazione saranno analizzati per la determi-nazione del contenuto di asparagina libera (LC MS a cura di CREA-AN) e i risultati daranno indica-zioni su quale tecnica di macinazione sia più conveniente per contenere la presenza dell’asparagina libera. Inoltre, verrà testato l’uso dell’FTIR-ATR, per sviluppare modelli predittivi per l’asparagina libera utilizzando come dati di riferimento quelli ottenuti dai metodi convenzionali (LC-MS). Un aspetto molto importante che verrà preso in considerazione nel presente progetto è anche la determinazione della qualità tecnologica degli sfarinati. Questa attività sarà curata dal CREA-CI e dal CREA-IT che vantano una consolidata esperienza in queste attività. Tra gli indicatori di qualità tecnologica saranno considerati: contenuto proteico, peso ettolitrico, peso dei 1000 semi, in-dice e quantità di glutine, indice di colore, indici alveografici (W e P/L), mixografici e farinografici, at-tività amilasica. Il progetto prevede anche lo sviluppo di un approccio microbiologico per il conte-nimento dei livelli di asparagina libera negli sfarinati. Le attività che si svolgeranno presso i laborato-ri di UNIMORE (UO3), si concentreranno sull'identificazione di ceppi microbici appartenenti al gruppo dei batteri lattici (LAB), capaci di metabolizzare l'asparagina libera presente negli sfarinati. Successivamente, presso i laboratori di tecnologia del CREA-CI e CREA-IT, sarà individuata la fa-se del processo di molitura e trasformazione più idonea per l'applicazione della coltura batterica se-lezionata, al fine di ottenere una significativa riduzione dell’asparagina. In particolare, si prevede che i livelli di questo aminoacido possano essere particolarmente elevati nell'aleurone e nei prodotti integrali. Pertanto, si ipotizza di impiegare i LAB durante la fase di condizionamento del grano, pri-ma della molitura, quando il grano viene addizionato con acqua e lasciato riposare prima della ma-cinazione. Inoltre, nel processo di panificazione, si prevede di testare i LAB anti-asparagina attra-verso prove di panificazione, al fine di valutare l'effetto del ceppo durante la lievitazione dell'impasto con le tre modalità previste (lievito di birra, lievito madre, lievito madre + starter microbico) e con di-versa temperatura e tempo di cottura (all’aumentare dell’una diminuisce l’altro). Saranno ottimizzate e standardizzate tutte le condizioni di lavoro e i parametri, quali il tempo e la temperatura di fermen-tazione e la concentrazione di inoculo. Il lavoro di ricerca proseguirà con l’esecuzione di test di pa-stificazione e panificazione sugli sfarinati a più alto contenuto di asparagina libera per quantificare l’entità dell’effetto termico sulla formazione dell’acrilammide in pasta (secca e cotta) e pane. Le pro-ve di pastificazione e panificazione verranno eseguite utilizzando gli impianti sperimentali pilota pre-senti nei Centri del CREA-CI di Foggia e Acireale e del CREA-IT, mentre le analisi del contenuto di acrilammide (LC-MS) saranno eseguite dal Centro CREA-AN. Inoltre, si valuteranno gli aspetti re-lativi alla texture dei prodotti, l’analisi sensoriale, l’attività antiossidante (attività a cura di CREA-CI, CREA-IT). Saranno applicati ai prodotti ottenuti dalle diverse fasi di produzione (granella, sfarinati, pasta e pane) i sistemi di codifica (LanguaLTM e FoodEx2) secondo procedure standardizzate e armonizzate a livello europeo ed internazionale a cura di CREA-AN. La codifica rappresenta uno strumento che permette di discriminare differenti prodotti lungo la filiera agroalimentare, in base a caratteristiche peculiari legate, i.e. ad ambiente, produzione, tecnologia di processo, etc. La condi-visione, tracciabilità e divulgazione dei dati a tutela di tutti i consumatori, permetterà di conoscere e promuovere le principali caratteristiche dei prodotti oggetto dello studio.
Pertanto, nella presente proposta progettuale che si articola in sei WP, abbiamo previsto lo svolgi-mento di prove agronomiche di concimazione a base di S e N in due località con due varietà di fru-mento duro tra le più coltivate e utilizzate per la pastificazione e panificazione. Le prove agronomi-che saranno svolte in due ambienti con differenti condizioni pedo-climatiche, presso le due aziende delle UO1 (CREA) e UO2 ( UNITUS) altamente specializzate nella conduzione di prove agronomi-che sui cereali. Nello specifico a Viterbo presso l’azienda Didattico-Sperimentale Nello Lupori dell’Università della Tuscia e a Foggia presso l’azienda sperimentale Manfredini del CREA-CI. La sperimentazione in campo prevede un disegno sperimentale con i seguenti trattamenti: due varietà di frumento duro; due dosi di fertilizzante N (80 kg/ha, 110 kg/ha), due dosi di fertilizzante S (30kg/ha, 50 kg/ha) tre repliche. La tecnica agronomica applicata relativamente ai tempi di interven-to sarà quella normalmente adottata in centro Italia per la produzione del frumento duro. Durante il ciclo vegetativo della coltura saranno rilevati paramenti fisiologici al fine di comprendere l’efficienza d’uso delle risorse da parte della pianta. Prima della semina e dopo la raccolta saranno effettuati campioni di suolo per rilevarne i principali parametri di fertilità. La valutazione degli stress di natura biotica della coltura in funzione delle tesi sperimentali avverrà in campo attraverso l’analisi epide-miologica ed eziologica delle principali malattie del grano duro con particolare riferimento alla fusa-riosi ed al “black points” della spiga. La granella ottenuta dalle prove agronomiche sarà analizzata per il contenuto di asparagina libera presso i laboratori del Centro CREA-AN che vanta una conso-lidata esperienza nel settore delle ricerche sugli alimenti. Verrà effettuata l’analisi dei principali gruppi funzionali -analisi “fingerprint”- sui campioni di granella ottenuti dalle prove agronomiche at-traverso la Spettroscopia Infrarossa a Trasformata di Fourier con Riflettanza Totale Attenuata (FTIR-ATR). La FTIR-ATR è un esempio di tecnica innovativa, rapida, non distruttiva, green, con una minima fase di preparazione del campione ed un uso minimo di solventi che permette di identi-ficare ‘l'impronta digitale’ di un prodotto. Il contenuto di asparagina libera sarà misurato anche con la tecnica LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) e ciò consentirà di ottenere una prima indicazione sulla corretta gestione della concimazione in termini quantitativi e di timing di applica-zione. Contestualmente i campioni che presentano il contenuto di asparagina libera più contrastante saranno avviati alle successive fasi di trasformazioni tecnologiche a cura del CREA-CI e CREA-IT. I campioni di grano duro saranno sottoposti, previo condizionamento, a macinazione con mulino a cilindri, al fine di ottenere semola e ‘scarti’ di macinazione (crusca + cruschello). Tali scarti ver-ranno micronizzati ed utilizzati in miscela con le semole per ottenere sfarinati integrali ricostituiti. I sottocampioni provenienti dalle diverse tecniche di macinazione saranno analizzati per la determi-nazione del contenuto di asparagina libera (LC MS a cura di CREA-AN) e i risultati daranno indica-zioni su quale tecnica di macinazione sia più conveniente per contenere la presenza dell’asparagina libera. Inoltre, verrà testato l’uso dell’FTIR-ATR, per sviluppare modelli predittivi per l’asparagina libera utilizzando come dati di riferimento quelli ottenuti dai metodi convenzionali (LC-MS). Un aspetto molto importante che verrà preso in considerazione nel presente progetto è anche la determinazione della qualità tecnologica degli sfarinati. Questa attività sarà curata dal CREA-CI e dal CREA-IT che vantano una consolidata esperienza in queste attività. Tra gli indicatori di qualità tecnologica saranno considerati: contenuto proteico, peso ettolitrico, peso dei 1000 semi, in-dice e quantità di glutine, indice di colore, indici alveografici (W e P/L), mixografici e farinografici, at-tività amilasica. Il progetto prevede anche lo sviluppo di un approccio microbiologico per il conte-nimento dei livelli di asparagina libera negli sfarinati. Le attività che si svolgeranno presso i laborato-ri di UNIMORE (UO3), si concentreranno sull'identificazione di ceppi microbici appartenenti al gruppo dei batteri lattici (LAB), capaci di metabolizzare l'asparagina libera presente negli sfarinati. Successivamente, presso i laboratori di tecnologia del CREA-CI e CREA-IT, sarà individuata la fa-se del processo di molitura e trasformazione più idonea per l'applicazione della coltura batterica se-lezionata, al fine di ottenere una significativa riduzione dell’asparagina. In particolare, si prevede che i livelli di questo aminoacido possano essere particolarmente elevati nell'aleurone e nei prodotti integrali. Pertanto, si ipotizza di impiegare i LAB durante la fase di condizionamento del grano, pri-ma della molitura, quando il grano viene addizionato con acqua e lasciato riposare prima della ma-cinazione. Inoltre, nel processo di panificazione, si prevede di testare i LAB anti-asparagina attra-verso prove di panificazione, al fine di valutare l'effetto del ceppo durante la lievitazione dell'impasto con le tre modalità previste (lievito di birra, lievito madre, lievito madre + starter microbico) e con di-versa temperatura e tempo di cottura (all’aumentare dell’una diminuisce l’altro). Saranno ottimizzate e standardizzate tutte le condizioni di lavoro e i parametri, quali il tempo e la temperatura di fermen-tazione e la concentrazione di inoculo. Il lavoro di ricerca proseguirà con l’esecuzione di test di pa-stificazione e panificazione sugli sfarinati a più alto contenuto di asparagina libera per quantificare l’entità dell’effetto termico sulla formazione dell’acrilammide in pasta (secca e cotta) e pane. Le pro-ve di pastificazione e panificazione verranno eseguite utilizzando gli impianti sperimentali pilota pre-senti nei Centri del CREA-CI di Foggia e Acireale e del CREA-IT, mentre le analisi del contenuto di acrilammide (LC-MS) saranno eseguite dal Centro CREA-AN. Inoltre, si valuteranno gli aspetti re-lativi alla texture dei prodotti, l’analisi sensoriale, l’attività antiossidante (attività a cura di CREA-CI, CREA-IT). Saranno applicati ai prodotti ottenuti dalle diverse fasi di produzione (granella, sfarinati, pasta e pane) i sistemi di codifica (LanguaLTM e FoodEx2) secondo procedure standardizzate e armonizzate a livello europeo ed internazionale a cura di CREA-AN. La codifica rappresenta uno strumento che permette di discriminare differenti prodotti lungo la filiera agroalimentare, in base a caratteristiche peculiari legate, i.e. ad ambiente, produzione, tecnologia di processo, etc. La condi-visione, tracciabilità e divulgazione dei dati a tutela di tutti i consumatori, permetterà di conoscere e promuovere le principali caratteristiche dei prodotti oggetto dello studio.